Рапид и этикетка

Том 12 научных отчетов, номер статьи: 21413 (2022) Цитировать эту статью

833 Доступа

4 цитаты

Подробности о метриках

В этой работе мы демонстрируем разработку быстрого и не требующего меток электрохимического биосенсора для обнаружения Listeria monocytogenes с использованием нового тиомерного материала нанощетки «стимул-реакция». Нанощетки были созданы путем одностадийного одновременного осаждения наноплатины (Pt) и альгинатных тиомеров (ALG-тиомера). Платформа нанощеток ALG-тиомер/Pt значительно увеличила среднюю электроактивную поверхность электродов в 7 раз и сохранила активационные свойства (pH-стимулированное осмотическое набухание) альгината. Диэлектрическое поведение во время приведения в действие щетки характеризовалось положительно, нейтрально и отрицательно заряженными окислительно-восстановительными зондами выше и ниже изоэлектрической точки альгината, что указывает на то, что поверхностный заряд ALG-тиомера играет важную роль в получении сигнала. Платформа ALG-тиомера была биофункционализирована с помощью аптамера, селективного в отношении белка интерналина А листерий, для биосенсорных целей. Загрузка аптамера была оптимизирована и исследованы различные стратегии захвата клеток (щетка вытянута или свернута). Максимальный захват клеток происходит, когда ALG-тиомер/аптамер находится в расширенной конформации (pH > 3,5), после чего следует измерение импеданса в свернутой конформации (pH <3,5). Низкие концентрации бактерий (5 КОЕ мл-1) были обнаружены в сложной пищевой матрице (куриный бульон), а тестирование селективности против других грамположительных бактерий (Staphylococcus aureus) показывает, что сродство к аптамеру сохраняется даже при этих значениях pH. Новый гибридный мягкий материал является одним из самых эффективных и быстрых (17 минут) биосенсоров L. monocytogenes на сегодняшний день и не требует предварительной обработки образцов, что представляет собой многообещающую новую платформу материала для обнаружения малых молекул или клеток.

Listeria monocytogenes – это вирулентная бактерия пищевого происхождения, повсеместно встречающаяся в окружающей среде (почве и воде), которая ежегодно вызывает сотни смертей в США1,2. Ежегодно регистрируется около 48 миллионов случаев заболеваний пищевого происхождения, почти 19% из которых связаны с заражением Listeria monocytogenes, что потенциально может иметь негативные экономические последствия в размере 15 миллиардов долларов США в виде затрат на здравоохранение, снижения производительности и гибели людей3,4. Имея такие симптомы, как мышечная боль, тошнота, диарея, рвота и озноб1, L. monocytogenes относится к числу самых смертоносных патогенов пищевого происхождения: уровень смертности среди лиц из группы высокого риска составляет до 30%5,6. Особенно опасно это для беременных женщин, хотя они, как правило, выздоравливают, но их дети могут не выжить2.

Listeria monocytogenes является патогеном, который трудно контролировать в условиях пищевой промышленности из-за его способности размножаться при низком содержании влаги, высокой солености или при температурах, присущих обычным холодильным/морозильным камерам7. Правило нулевой толерантности к L. monocytogenes в готовых к употреблению продуктах было введено Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA), Министерством сельского хозяйства США (USDA) и Европейским союзом (ЕС)1, дополненным Растущее число отзывов продуктов питания, связанных с заражением листериями, в последние годы8 еще больше усиливает потребность в методах обнаружения патогенов в режиме реального времени, которые могут идентифицировать зараженные пищевые продукты до того, как они попадут к населению.

Современные методы обнаружения листерий на предприятиях пищевой промышленности, включая общее количество жизнеспособных микроорганизмов (TVC), ИФА (иммуноферментный анализ) и ПЦР (полимеразная цепная реакция), подвержены ошибкам и ложным показаниям. и для завершения потребуются дорогостоящие лабораторные условия с высококвалифицированным персоналом9,10. Результаты испытаний этих методов сильно задерживаются из-за необходимости двух последовательных этапов обогащения (до 48 часов) для концентрации/амплификации бактерий перед этапом качественного обнаружения11, поскольку этим методам недостаточна чувствительность [пределы обнаружения (LOD) ~ 100 КОЕ мл-1). ]12,13 и не могут напрямую обнаружить низкие уровни патогенов в сложных образцах, таких как среда, бульон или гомогенизированная ткань.

0.97), the sensitivity to the target bacterium was obtained using the slope of the linear portion and then the 3σ method was used to calculate the limit of detection (LOD)39. Change in impedance (\(\mathrm{\Delta Z}= {Z}_{bacteria}-{Z}_{no \, bacteria}\)) was used to illustrate the electrodes performance independent of media. Selectivity to L. monocytogenes was evaluated by determining sensitivity and LOD in the presence of the identical concentration of another Gram-positive bacteria (S. aureus) in PBS and in sterile vegetable broth./p>

3.5 is noted as (EX), the collapsed brush conformation at pH < 3.5 is noted as (COL), the cell capture state is noted by (cap) and the electrochemical measurement step is noted by (meas). Cell capturing in the extended conformation (pH 7) and sensing at collapsed state (pH 3) provided the highest impedance values (p < 0.05) for all cutoff frequencies and, therefore, sensing efficiency (see also Bode plots in Fig. S3 in the supporting information). The optimum capture of targeted bacteria at the extended form can be related to a higher contact area with the tested solution and an increased probability of aptamer-cell interaction, compared to pH 3 at which the brushes are contracted, and the receptor binding site(s) may be inaccessible. Similar to our previous work on this capture strategy, it is likely that the cells become entangled in the polymer matrix during the sensing step, where aptamer-target binding may no longer be the mechanism for cell capture but rather entanglement during nanobrush collapse. The specificity for this detection platform is rooted in the initial affinity between aptamer and target at pH 7 (extended ALG-thiomer nanobrush), where the collapse at pH 3 likely causes secondary structure changes in the aptamer but also entraps cells in the polymer matrix./p> 0.05) on the LOD (4.5 ± 0.8 CFU mL−1 with L. monocytogenes alone and 5.7 ± 2.1 CFU mL−1 with both bacteria) indicating no cross-reaction between the sensor and S. aureus. The sensitivity increased (p < 0.05) from 39.21 ± 2.61 Ω/log(CFU mL−1) with L. monocytogenes alone to 69.34 ± 2.79 Ω/log (CFU mL−1) when S. aureus was also present. The linear range also changed from 101 to 106 CFU mL−1 with only L. monocytogenes in PBS to 101–105 CFU mL−1 in the bacteria mixture. Ohk et al.29 presented a LOD of 103 CFU mL−1 using the same aptamer in a fiber-optic biosensor to detect Listeria spp. Recently, Oliveira et al.31 using the same aptamer presented similar LODs compared to the current study for L. monocytogenes alone in PBS and in the presence of S. aureus, 2.5 and 2.6 CFU mL−1, respectively; using actuation of chitosan/platinum brushes. While antibody sensors are reported to be prone to give false-positive reactions with S. aureus, which is also a protein A carrier, the aptamer used in the present work was proven to be selective to L. monocytogenes29. This aptamer targets the surface protein Internalin A which is one of the major invasion proteins involved in pathogenesis29. Despite the fact that this protein is structurally analogous to certain cell-wall proteins with internal repeats identified in members of the genera Staphylococcus and Streptococcus65, the present results corroborate that this aptamer can be selective to L. monocytogenes./p> 0.05) to the results in PBS. These results also indicate that the aptamer is able to selectively bind to L. monocytogenes even in complex food matrices. Using the same aptamer, Hills et al.30 reported a slightly higher LOD of 9.1 CFU mL−1 in vegetable broth with a layer by layer reduced graphene oxide/nanoplatinum/chitosan brush electrode that actuated based on chitosan's pH-response./p>

Блог